做過PCR實驗的朋友都知道，熒光定量PCR實驗過程產生的熒光信號十分微弱，并有一定的背景信號，這就好比眾里尋他千百度，他還不知在何處......
這對PCR儀的光學檢測技術提出了很高的要求，光學檢測技術一直是qPCR儀的核心技術，它決定了實驗的準確性、可靠性和重復性。
下面我們一起聊下熒光定量PCR儀的光學系統吧。
按照結構的不同，熒光定量PCR儀的傳導光路主要分為斜射式、透射式和共聚焦式。傳導光路的主要作用是傳輸激發光和產生的熒光。
圖1
共聚焦式是其中使用較廣的一種檢測光路方式，如圖1所示，激發光路的激發光經過二向色鏡反射后照射到待檢測樣品池上，產生的熒光會透射過二向色鏡再到達熒光探測器。
朗基科儀的熒光定量PCR頂部檢測方式就是使用了這種共聚焦傳導光路，激發光路和檢測光路采用同一光學光路，從而有效抑制了激發光和雜散光的干擾，提高了系統的信噪比。
一般情況下，根據光產生的原理和電傳播原理，一個完整的熒光信號檢測系統需要光源、透鏡、濾光片及探測器組成。
那么探測器的選擇也至關重要。對探測器的要求是高靈敏度、響應速度快、噪聲低。
CCD
電荷耦合器件（ＣＣＤ）是2０世紀７０年代發展起來的一種具有將光轉換為電荷的傳感器，它使得圖像處理變得可能，它們由一系列被稱為像素的排列成正方形或矩形陣列的感光元件組成。當ＣＣＤ曝光時，形成被觀察物體的圖像，該圖像可以從ＣＣＤ中提取并存儲在計算機上用于以后的分析。ＣＣＤ廣泛應用在計算機圖像處理、醫學診斷、非接觸性檢測等領域，尤其適用于圖像識別技術。
由于CCD光敏管可做的很小(約10um)，所以它的圖像分辨率很高。CCD相機創建的圖像質量高、噪點低。同時CCD相機已大批量生產很長一段時間，產品更成熟，像素更高。
這種采用共聚焦式傳導光路以及選用CCD作為探測器的光學系統，在儀器界內稱為頂部檢測CCD成像方式。
它是目前熒光定量PCR儀的蕞佳光學檢測技術方案。國內頂尖qPCR儀和國外主流qPCR儀都采用這種技術，比如美國Thermofisher的Q5/7500，ROCHE的LC480/96，國內有朗基的Q1000/Q2000系列產品。
這種頂部檢測技術采用相機原理，直接從PCR管的上方對所有樣品進行同步實時檢測，采光面平行性好，采光面積大，因此小體積反應液都能放心使用（如圖2）。
圖2 10ul，2倍稀釋4個重復
在Q2000上獲得的結果
眾所周知，采用頂部檢測技術的qPCR儀所需要的反應體積只需10-20ul即可，（而其他檢測方案的qPCR儀至少需要20ul以上），從而很大程度地降低了實驗成本。實驗達人們蕞清楚qPCR試劑有多貴了，能省一半的試劑就是省下大把的銀子啊。
行業內比較常用的檢測方式還有機械掃描技術和光纖技術。
1. 運動的機械部件不可避免會產生發熱、磨損及走偏等現象，導致故障率高。雖然儀器成本低，但后期維護成本非常高;
2. 逐孔掃描，檢測時間長，實驗效率低。
1. 光纖直徑比頭發絲還細，通光量非常低，導致熒光信號弱，難以收集;
2. 容易折斷，彎曲半徑大，導致儀器尺寸大;
3. 光纖表面容易被污染，不易清潔，極易堵塞，導致信號不穩定。
不同的檢測方式會給后續檢測帶來不同程度的影響，在了解完以上光學系統的核心技術之后，小伙伴們應該心中有譜了吧？小朗希望各位都能買到一臺稱心如意的qPCR儀。
